【摘 要】利用自行设计构建的可变入射角的波长型表面等离子体共振(SPR)检测仪, 在不同浓度的蔗糖溶液中测定了不同入射角度(80°～66°)的共振曲线, 经过处理得到共振峰位、半高宽及灵敏度随入射角和样品折射率变化的三维图像. 在此基础上探讨了波长型SPR检测仪的主要参数对仪器性能的影响, 从理论和实验上证明了影响灵敏度的主要因素为共振波长, 并且随着共振波长的增大, 检测灵敏度迅速提高.

　　SPR检测技术的目标之一是高灵敏度检测.Akimoto等［6］报道了在不同入射角度下，共振波长的灵敏度会发生改变，并且在入射角较小(68°)时其仪器的灵敏度和检出限都明显提高［6］.为了系统地研究不同入射角度及不同折射率的介质对灵敏度的影响，为仪器的设计及制造提供参考和指导，我们构建了一套可以改变入射角的波长型SPR检测装置，并用不同浓度的蔗糖溶液作为待测物质进行了一系列实验，获得了不同入射角度下的波长型SPR检测仪的共振峰位、半高宽及灵敏度等实验参数.探讨了波长型SPR检测仪随入射光角度的改变对灵敏度的影响，从理论和实验上分析了影响灵敏度的一些因素.为波长型SPR检测仪器的设计以及实验参数选取提供了重要的参考价值.

　　【关键词】表面等离子体共振(SPR);波长型SPR检测仪;灵敏度;入射角;共振波长

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　　【作者单位】吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,长春,130012;吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,长春,130012;吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,长春,130012;吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,长春,130012;吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,长春,130012

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　　式中，neff表示被检测物质的等效体相折射率，ld表示消失场的衰减距离，一般为入射光波长的25% ～50%，n(z)表示生物分子在距传感膜不同距离(z)处的折射率.在一些限定条件下可以根据式(1)用体相折射率表示生物分子的折射率，从而根据图3确定其共振峰位.

　　对图3的共振峰位随入射角和样品折射率变化的响应曲线求斜率，得到灵敏度的三维图像如图4 (A)，其中背景颜色表示灵敏度.由图4(A)可以看出，体系的灵敏度随着共振波长的增加而明显增强，但与样品的折射率等因素则没有明显的联系.从图4中可以方便地查出各入射角(67°～80°)及各种折射率(1.333～1.390)下的灵敏度.

　　从实验和理论上验证了影响灵敏度的主要因素为共振波长，而且随着共振波长的红移，检测灵敏度迅速增大.但是在实际应用中还应该考虑CCD检测范围(通常检测波段为400～1000 nm)的限制.综合考虑，SPR检测适宜的共振波长为800～1000 nm，此时灵敏度可以达到5000 nm/RIU以上.对于一般水相的待测物(折射率为1.333～1.340)，参照本文的三维图像，可以选择入射角为67°左右.对于其它样品也可以根据其等效折射率［通过式(1)计算或测量得知］选择合适的入射角度，以调控共振波长，获得较高的检测灵敏度和分辨率.

　　自从20世纪80年代Liedberg等［1］将表面等离子体共振(SPR)检测方法用于生物传感领域，SPR检测技术获得了空前的发展.经过了30年的发展后，SPR技术已经成为一种比较成熟且广泛用于生物及化学领域的检测方法，尤其适合于生物分子之间相互作用的研究.目前SPR检测方法主要有消失场激发和光栅激发两种激发方式，其中消失场激发装置更容易实现，灵敏度更高，SPR检测仪主要采用这种方式.消失场激发方式分为用单色光激发检测共振角的角度型SPR系统和用白光激发检测共振波长的波长型SPR系统.角度型SPR系统比较成熟，大多数商品仪器采用这种检测方式，目前已经实现了微型化［2］.波长型SPR生化分析系统由于光谱仪技术的成熟而具有装置更简单、工作性能更稳定和容易进行实时监测等优势，使得这类仪器发展迅速［3，4］，并已商品化，如Thermo公司的Nicolet傅里叶型生物检测系统.目前报道主要集中在生物和化学检测体系，仪器结构一般采用角度型或固定角度入射的波长型［5］，而探讨入射角及样品的折射率等与灵敏度关系的实验和计算则较少，而这些数据是指导仪器设计的重要参数.

　　式中，np为棱镜的折射率，θ为入射角度.假设表面等离子体传输方向在x方向，则式(3)表示表面等离子体波的波矢与入射光在水平方向的波矢的分量相等.

　　将共振条件绘成图5，其中曲线d为表面等离子体的色散曲线.直线a为真空中光的色散曲线，其斜率为光速c，与曲线d交点为原点，因此不会产生表面等离子体共振.用衰减全反射耦合方式，当入射角度为θ1时，其色散曲线的斜率为c/(npsinθ1)，小于直线a的斜率c，因此与曲线.当用更小的入射角度θ2入射时，斜率会变大，与曲线的，体现在SPR光谱上为入射角变小，则共振峰红移，且越接近曲线a，共振峰变化越快，与图2的实验现象相符.

　　由于玻璃的色散率(dnp/dλ)为10－5量级，而金的色散率(dεm/dλ)为10－2量级，故式(5)可以近似为

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　　从式(6)中可以看出，影响波长型表面等离子体的因素主要取决于金属膜的介电常数与色散率的比值和样品的折射率.实际上在SPR检测时样品折射率变化很小，它对灵敏度的影响基本可以忽略.随着波长的增大，金的介电常数与色散率的比值迅速增大，因此用金膜的波长型SPR检测仪的灵敏度随着波长的增大而急剧增大.

　　如果已知待测生物样品的相关信息，如折射率及在传感膜上的厚度和分布等，就可以通过下式将加入样品后引起的传感膜附近的折射率变化等效于体相折射率的变化［7］:

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　　本质灵敏度［8］(定义为灵敏度/半高宽)是确定仪器分辨率的一个很重要的参数.图4(B)为本质灵敏度的三维图像.可以看出，本质灵敏度随着共振波长的增加而明显增加，随样品折射率的增大略有增大.

　　所用光源为DO4F型溴钨灯，光纤为P600-2-VIS/NIR型光纤，检测器为USB4000微型光纤光谱仪(美国海洋光学公司).2WAJ型阿贝折射率仪(上海精密仪器仪表公司).蔗糖为分析纯试剂，水为去离子水.

　　配制质量分数为0，4%，8%，12%，16%，20%，24%，18%，32%，36%的蔗糖水溶液，并用阿贝折射率仪依次测定其折射率.将无蔗糖溶液通入样品池，转动测角仪，使入射角从80°转至66°，每间隔1°采集一个共振曲线%的蔗糖溶液冲洗并测量.然后依照上述步骤分别检测8%，12%，16%，20%，24%，28%，32%，36%的蔗糖溶液.

　　式中，k0为入射光的波矢，εm为金属膜介电常数的实部，na为待测样品的折射率.

　　入射光与表面等离子体共振的条件是表面等离子体波与入射光满足频率和波矢相等.由于消失波激发的表面等离子体的振动频率与消失波相同，则只要满足表面等离子体与入射光波矢相等即可以实现共振［9］，即:表面等离子体在金属膜与待测样品界面处的色散关系为

　　图2(A)和(B)分别为不同入射角下水的SPR吸收曲线及其共振峰的峰位和半高宽随入射光角度的变化曲线.可以看出，随着入射角的减小，SPR吸收峰逐渐红移，且红移越来越快;半高宽则逐渐变大.对于同一样品，在不同的入射角下，其共振波长不同.

　　将不同浓度(0～36%)的蔗糖溶液在入射角从80°到66°的SPR共振曲线的吸收峰位及半高宽进行处理并绘制成三维图像(图3).图3中的折线表示不同入射角下随蔗糖浓度变化的SPR吸收峰位变化.可以看出，随着样品折射率的增加，SPR共振波长的峰位逐渐红移，且在不同入射角下，红移的速度也不相同，即灵敏度不同［灵敏度定义为Δ(共振波长)/Δ(样品折射率)］.图3的背景为共振峰的半高宽.从图3可以看出，共振波长越长，共振峰的半高宽越大，而随着待测样品折射率的增加有减小的趋势.从图3可以方便地查出不同样品在不同入射角下的共振峰位及半高宽的信息.

　　实验仪器为自行设计构建的可改变激发光入射角的波长型SPR检测仪，示意图见图1.由溴钨灯发出的白光(发射光波长400～950 nm)经光纤传输到光纤耦合器上，形成平行的白光光束，承载光纤耦合器的旋臂固定在测角仪基座上.入射光入射到半圆柱棱镜(BK7玻璃，折射率为1.515)上，棱镜底面镀有约50 nm的金膜，入射光在棱镜-金膜界面形成的消失波激发金膜与样品界面的表面等离子体，通过采集和检测棱镜底面反射光的光谱可知其共振波长.反射光通过光纤耦合器进入光纤传输到光谱仪中检测其光谱.θ-2θ测角仪即载物台，与旋臂转动角度满足θ-2θ的关系，从而使入射光、棱镜底面和反射光满足镜面反射的条件.

　　实验中采用的棱镜材料为BK7玻璃，金的介电常数采用1972年的数据［11］，根据式(5)可绘出图6.其中理论曲线中实验点为各个入射角及样品折射率下的灵敏度数据，实线为四阶多项式拟合曲线)计算的灵敏度曲线.可以看出，理论计算的曲线与实验测量的曲线基本相符，而且均随共振波长的增大而迅速增大.

　　此外，在设计固定角度入射的波长型SPR仪器时，也可根据不同的测量对象设计合适的入射角，从而使共振峰位在合适的波长范围内.因此该研究对波长型SPR检测仪器的设计有重要的参考价值和指导意义.